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細胞轉(zhuǎn)染實驗效率低如何破?
發(fā)布時間： 2021-11-25 點擊次數(shù)： 2643次細胞轉(zhuǎn)染效率低如何破?
細胞轉(zhuǎn)染是細胞生物學和分子生物學的一種常用的技術手段。而轉(zhuǎn)染效率低卻是實驗科研者經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細胞轉(zhuǎn)染，更是因為難度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應該是談原代細胞色變。
當實驗進行到轉(zhuǎn)染這一步時有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?
1.細胞系的選擇：
細胞系選擇有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個容易做的。越是接近體內(nèi)的真實情況的原代細胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設計實驗時需要考慮的因素，姑且不論。不過因為受限于特定的細胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實驗室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。
2. 預實驗準備充足
我們做轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：試劑的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等。
3.電轉(zhuǎn)染電壓控制
做電轉(zhuǎn)的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗，多摸索條件。對于大多數(shù)細胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是*的。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉(zhuǎn)染效率也大大降低。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷。
4.試劑品質(zhì)選擇
有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。有老師當時做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。最后發(fā)現(xiàn)，原來是轉(zhuǎn)染試劑過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)經(jīng)驗，盡量使用開封半年內(nèi)的，因為過了半年后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性大大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻大大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。而現(xiàn)在，出了第三代多肽小分子材料的轉(zhuǎn)染試劑，對細胞毒性低，適用細胞廣，轉(zhuǎn)染效率高，這邊十分推薦ZETA LIFE品牌的Advanced系列DNA、RNA的轉(zhuǎn)染試劑，合適目錄大多數(shù)的細胞轉(zhuǎn)染實驗。
5.血清培養(yǎng)很重要
轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導致細胞大量死亡。如果用的是Lipo系列的脂質(zhì)體材料轉(zhuǎn)染試劑一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。如果是Advanced系列DNA、RNA的轉(zhuǎn)染試劑則為轉(zhuǎn)染24小時后進行正常換液，不能像Lipo系列轉(zhuǎn)染試劑一樣在4-6小時后換液。其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細胞快速生長。那么，什么是最佳時機呢?在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關注的，一般建議使用超低內(nèi)毒素胎牛血清。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助。
6. 防止細胞污染
細胞污染也是造成細胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。業(yè)內(nèi)有個一個獨門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75%乙醇沉淀，這樣就除菌了。
7.質(zhì)粒數(shù)量保證
轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候，就應該對質(zhì)粒進行純化和濃縮。
8.注意細節(jié)
在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié)，但是如果不注意的話，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。
9.細胞狀態(tài)良好
轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過1—2次傳代，以保證細胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細胞生長到幾乎滿片時就要趕快進行下一次傳代，千萬不要使細胞保持融合超過24小時，因為一旦長滿了，細胞們就“故步自封"不思轉(zhuǎn)染啦。活力充沛的年輕細胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。
大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體，細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會導致和轉(zhuǎn)染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(融化細胞的進一步傳代不會馬上降低轉(zhuǎn)染效率)。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結(jié)果。
10. 恰到好處的鋪板密度：
轉(zhuǎn)染時的細胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細胞密度會導致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細胞密度為40%-80%，但這個需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書——陽離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù)，有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。
不同的實驗目的也會影響轉(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉(zhuǎn)染的試劑需要特別注意。
11. 溫暖舒適的培養(yǎng)基
健康的細胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎。不同的細胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補充添加劑等等。
12.抗生素的控制
支原體、細菌、真菌污染，無論對于細胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛"，可能會嚴重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以整個過程都不要用抗生素。
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